Новый метод доставки днк в эмбриональные стволовые клетки. Введение рекомбинантной днк в клетки бактерий и отбор трансформантов Методы введения рекомбинантной днк клетку

Генная инженерия – Технология рекомбинантной ДНК

Новый метод доставки днк в эмбриональные стволовые клетки. Введение рекомбинантной днк в клетки бактерий и отбор трансформантов Методы введения рекомбинантной днк клетку

Генная инженерия – использование технологий создания рекомбинантной ДНК для модификации генома организма с целью достижения желаемых признаков (черт). 

Технология рекомбинантной ДНК – это технология объединения молекул ДНК из разных видов с помощью лабораторных методов генетической рекомбинации. Результатом этих генетических манипуляций является молекула или вектор рекомбинантной ДНК (рДНК).

Добавление чужеродной ДНК в форме рекомбинантных ДНК-векторов, которые генерируются путем молекулярного клонирования, является наиболее распространенным методом генной инженерии.

Организм, который получает рекомбинантную ДНК, называется генетически модифицированным организмом (ГМО).

Когда вводится чужая ДНК, имеющая происхождение от другого вида, организм-хозяин называется трансгенным.

Химера

Сегодня генетики часто используют термин «химера» для описания генетически модифицированных организмов, которые содержат гены неродственных видов.

Первый химерный организм был создан в 1973 году, когда Стэнли Коэн (Stanley Cohen) и Герберт Бойер (Herbert Boyer) успешно разработали бактериальную плазмиду, которая могла экспрессировать ген амфибий.

Технология рекомбинантной ДНК

Чтобы вставить ген млекопитающего в прокариотическую клетку, должны быть выполнены два основных требования.

Во-первых, исследователи должны выделить нужный ген из целого генома.

Во-вторых, исследователи должны найти способ гарантировать, что прокариотическая клетка может правильно экспрессировать ген млекопитающих.

Создание и выделение гена для клонирования

Эукариотическая хромосома и отобранные бактериальные плазмиды, которые должны использоваться в качестве вектора, обрабатываются рестрикционной эндонуклеазой.

Когда эукариотические фрагменты ДНК соединяются с разорванными плазмидами, некоторые из плазмид рекомбинируют с эукариотической ДНК.

Затем плазмиды возвращаются бактериям-хозяевам путем культивирования в растворе таким образом, что некоторые из бактерий поглощают плазмиды.

Однако многие плазмиды не содержат рекомбинантную ДНК, а из тех, которые содержат, только небольшая часть имеет в своем составе нужный (целевой) ген млекопитающих. Поэтому следующим шагом является выделение бактериальных колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды с необходимым геном.

Этот шаг включает в себя два этапа скрининга:

Этап 1: Определение бактериальных колоний, которые содержат рекомбинантные плазмиды.

Только часть бактерий содержит в себе рекомбинантные плазмиды. Чтобы определить такие колонии, исследователи обычно используют плазмиды, несущие определенный генетический маркер, то есть черту, которая легко идентифицируется.

Этап 2: Определение бактерий, содержащих желаемый ген.

Когда ДНК млекопитающего разрушается эндонуклеазой, результатом могут быть сотни или тысячи фрагментов. Из них только небольшая часть будет содержать ген-мишень.

В результате требуется еще один шаг чтобы найти те бактерии, которые содержат плазмиду, имеющую нужный ген.

Идентификация этих бактерий включает в себя использование технологии гибридизации нуклеиновых кислот.

Если по крайней мере часть последовательности нуклеиновой кислоты нужного гена известна, эту информацию можно использовать для конструирования зонда из РНК или одноцепочечной ДНК. Зонд состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарной известной последовательности гена, а также радиоактивную или флуоресцентную метку.

При использовании зонда ДНК из каждой бактериальной колонии сначала нагревают, чтобы отделить друг от друга две ее цепи, а затем смешивают с раствором, содержащим зонд.

Зонд формирует спаренные основания с его комплементарной последовательностью ДНК, что дает возможность исследователям определить местонахождение метки, чтобы определить какая бактериальная колония содержит желаемый ген.

Как только колония идентифицирована, ее можно культивировать для получения генного продукта.

Экспрессирование генов эукариот в прокариотических векторах

Во-первых, промоторная последовательность эукариотического гена не будет распознаваться РНК-полимеразой из прокариот.

Чтобы преодолеть эту проблему, исследователи разработали особый тип плазмиды, называемый вектором экспрессии (expression vector).

Экспрессионный вектор представляет собой плазмиду, которая содержит прокариотическую промоторную последовательность непосредственно перед тем местом, которое узнается рестриктазой.

Таким образом, когда происходит рекомбинация, вставленная последовательность ДНК будет лежать близко к бактериальному промотору. Затем клетка-хозяин распознает промотор и транскрибирует ген.

Во вторых, прокариоты не содержат малые ядерные РНК (Small nuclear ribonucleic acid, snRNA) или сплайсосомы (spliceosomes), необходимые для удаления интронов из эукариотического пре-мРНК-транскрипта.

Это означает, что транскрипт мРНК в прокариоте будет содержать как кодирующие, так и некодирующие последовательности, которые будут транслироваться клеткой.

Решение этой проблемы заключалось в разработке искусственных эукариотических генов, не содержащих интронов.

Исследователи сначала изолируют готовую мРНК от цитоплазмы эукариотической клетки. Затем мРНК помещают в раствор с ферментом, называемым обратной транскриптазой, который создает цепь ДНК, комплементарную цепи мРНК.

Эту ДНК-цепь затем выделяют и добавляют к раствору, содержащему ДНК-полимеразу, которая синтезирует другую комплементарную цепь ДНК. В результате получается двухцепочечная молекула ДНК, содержащая только кодирующие части эукариотического гена.

Эта синтетическая молекула называется комплементарной ДНК или кДНК (cDNA).

Другим решением обеих этих проблем является использование эукариотических клеток в качестве клонирующих векторов. Дрожжевые клетки часто используются для этой цели, так как их легко культивировать. Некоторые дрожжевые клетки также содержат плазмиды, поэтому подобные способы могут быть использованы для вставки рекомбинантной ДНК в вектор клонирования.

Вставка ДНК в растительные или животные векторы

В некоторых случаях только растительные или животные клетки будут содержать все ферменты, необходимые для правильного производства желаемого белка. Такие клетки могут быть выращены в культурах, чтобы служить векторами клонирования.

Однако, поскольку эти клетки труднее культивировать, то и сложности вставки чужеродной ДНК, соответственно, возрастают.

Чтобы обойти этот очевидный барьер и поместить чужеродные гены в эукариотические геномы, биологи разработали и используют несколько методов.

  1. Ti (опухолеобразующая) плазмида
  2. Кратковременный электрический ток
  3. Генная пушка (DNA particle gun)

Источник: http://biology.reachingfordreams.com/ru/%D0%BC%D0%BE%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%83%D0%BB%D1%8F%D1%80%D0%BD%D0%B0%D1%8F-%D0%B3%D0%B5%D0%BD%D0%B5%D1%82%D0%B8%D0%BA%D0%B0/%D0%BC%D0%B5%D1%82%D0%BE%D0%B4%D1%8B-%D0%BC%D0%BE%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%83%D0%BB%D1%8F%D1%80%D0%BD%D0%BE%D0%B9-%D0%B3%D0%B5%D0%BD%D0%B5%D1%82%D0%B8%D0%BA%D0%B8/62-%D0%B3%D0%B5%D0%BD%D0%BD%D0%B0%D1%8F-%D0%B8%D0%BD%D0%B6%D0%B5%D0%BD%D0%B5%D1%80%D0%B8%D1%8F

Рекомбинантная ДНК: описание, характеристики

Новый метод доставки днк в эмбриональные стволовые клетки. Введение рекомбинантной днк в клетки бактерий и отбор трансформантов Методы введения рекомбинантной днк клетку

Рекомбинантная ДНК – это молекулы, образованные лабораторными методами генетической рекомбинации для объединения генетического материала из множества источников. Она возможна потому, что молекулы ДНК всех организмов имеют одинаковую химическую структуру и отличаются только нуклеотидной последовательностью в ее пределах.

Создание

Молекулярное клонирование – это лабораторный процесс, используемый для создания рекомбинантной ДНК. Это один из двух наиболее широко используемых методов, наряду с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Он позволяет управлять репликацией любой конкретной последовательности ДНК, выбранной экспериментатором.

Есть два фундаментальных различия между методами рекомбинантных ДНК. Одним из них является то, что молекулярное клонирование включает репликацию в живой клетке, а ПЦР – в пробирке. Другое отличие состоит в том, что первый метод допускает вырезание и вставку последовательностей ДНК, а второй усиливается путем копирования существующей очередности.

Вектор ДНК

Получение рекомбинантной ДНК требует клонирующего вектора. Он происходит от плазмид или вирусов и представляет собой относительно небольшой сегмент.

Выбор вектора для молекулярного клонирования зависит от выбора организма-хозяина, размера клонируемой ДНК и от того, должны ли экспрессироваться чужеродные молекулы.

Сегменты могут быть объединены с использованием различных методов, таких как клонирование рестриктазы / лигазы или Сборки Гибсона.

В стандартных протоколах клонирование включает семь этапов.

  1. Выбор организма-хозяина и вектора клонирования.
  2. Получение ДНК-вектора.
  3. Формирование клонируемой ДНК.
  4. Создание рекомбинантной ДНК.
  5. Введение ее в организм хозяина.
  6. Отбор организмов, ее содержащих.
  7. Выбор клонов с желаемыми вставками ДНК и биологическими свойствами.

После трансплантации в организм хозяина чужеродные молекулы, содержащиеся в рекомбинантной конструкции, могут экспрессироваться или неэкспрессироваться. Экспрессия требует реструктуризации гена для включения последовательностей, которые необходимы для продуцирования ДНК. Она используется трансляционным аппаратом хозяина.

Как работает

Рекомбинантная ДНК работает, когда клетка-хозяин экспрессирует белок из рекомбинантных генов. Экспрессия зависит от окружения гена набором сигналов, которые обеспечивают инструкции для его транскрипции. Они включают в себя промотор, связывание рибосомы и терминатор.

Проблемы возникают, если ген содержит интроны или сигналы, которые действуют как терминаторы для бактериального хозяина. Это приводит к преждевременному прекращению.

Рекомбинантный белок может быть неправильно обработан, свернут или подвергнут разложению. Его производство в эукариотических системах обычно происходит в дрожжах и нитчатых грибах.

Использование животных клеток затруднено из-за того, что многим нужна прочная опорная поверхность.

Организмы, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, имеют явно нормальные фенотипы. Их внешний вид, поведение и метаболизм обычно не изменяются. Единственный способ продемонстрировать наличие рекомбинантных последовательностей – это исследовать саму ДНК с использованием теста полимеразной цепной реакции.

В некоторых случаях рекомбинантная ДНК может оказывать вредное воздействие. Это может случиться, когда ее фрагмент, содержащий активный промотор, располагается рядом с ранее молчащим геном клетки-хозяина.

Использование

Технология рекомбинантной ДНК широко используется в биотехнологии, медицине и исследованиях. Ее белки и другие продукты можно найти практически в каждой западной аптеке, ветклинике, кабинете врача, медицинской или биологической лаборатории.

Наиболее распространенным применением является фундаментальное исследование, в котором технология важна для большинства современных работ в биологических и биомедицинских науках.

Рекомбинантная ДНК используется для идентификации, картирования и последовательности генов, а также для определения их функции. Зонды рДНК используются для анализа экспрессии генов в отдельных клетках и в тканях целых организмов.

Рекомбинантные белки используются в качестве реагентов в лабораторных экспериментах. Некоторые конкретные примеры приведены ниже.

Рекомбинантный химозин

Найденный в сычуге, химозин представляет собой фермент, необходимый для производства сыра. Это была первая генетически модифицированная пищевая добавка, используемая в промышленности. Микробиологически продуцированный рекомбинантный фермент, структурно идентичный ферменту, полученному от теленка, стоит дешевле и производится в больших количествах.

Рекомбинантный человеческий инсулин

Практически полностью заменил инсулин, полученный из животных источников (например, свиней и крупного рогатого скота) для лечения инсулинозависимого диабета. Рекомбинантный инсулин синтезируется путем введения гена человеческого инсулина в бактерии рода этерихий или дрожжи.

Гормон роста

Назначается пациентам, у которых гипофиз генерирует недостаточное количество гормона роста для поддержания нормального развития. До того, как стал доступен рекомбинантный гормон роста, его получали из гипофиза трупов. Эта небезопасная практика привела к тому, что у некоторых пациентов развилась болезнь Крейтцфельда-Якоба.

Рекомбинантный фактор свертывания крови

Это свертывающий кровь белок, который вводят пациентам с формами гемофилии с нарушением свертываемости крови. Они не способны продуцировать фактор VIII в достаточных количествах. До разработки рекомбинантного фактора VIII белок получался путем обработки большого количества крови человека от нескольких доноров. Это несло очень высокий риск передачи инфекционных заболеваний.

Диагностика заражения ВИЧ

Каждый из трех широко используемых методов диагностики ВИЧ-инфекции был разработан с использованием рекомбинантной ДНК. Тест на антитела использует ее белок. Он определяет наличие генетического материала ВИЧ с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Разработка теста стала возможной благодаря молекулярному клонированию и анализу последовательности геномов ВИЧ.

Источник: https://FB.ru/article/470776/rekombinantnaya-dnk-opisanie-harakteristiki

Поделиться:
Нет комментариев

    Добавить комментарий

    Ваш e-mail не будет опубликован. Все поля обязательны для заполнения.